研之有理|低分子量肝素產品生物樣本分析探討

萬邦醫藥分析測試中心在復雜基質樣本生物分析技術領域已經深耕了17年，具備了卓越的技術實力和豐富的實踐經驗，包括在低分子量肝素類領域已完成抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性分析方法的方法驗證。

分析測試中心擁有符合中美雙報要求的大小分子生物樣本檢測平臺，嚴格的質量管理體系以及一套先進的生物樣本分析設備，能夠滿足各種復雜的生物樣本分析需求；已經完成了超過500項的生物樣本分析實驗，檢測了超過90萬支樣本。我們接受了國家局的20多次核查，并成功獲得了40多次免核查的認可。專業高效的生物樣本分析團隊，將為您提供藥代動力學生物分析服務、免疫原性生物分析服務、藥效學和生物標志物研究等服務，誠摯歡迎全國各地的朋友前來合作交流。

 低分子肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）主要用于治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥(心絞痛、心肌梗塞等)，同時，在婦產科、生殖科等科室的抗凝血輔助治療中的作用日益突顯。低分子肝素因分子量小、副作用少、抗凝效果好，逐步成為臨床治療的優選。隨著人口老齡化，心血管患病人數增加等原因，使得中國肝素類藥物市場前景廣闊。臨床上常用的低分子量肝素（LMWH）產品有依諾肝素鈉、達肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉和汀肝素鈉等。但因LMWH體內劑量與PK關系尚未闡明，且LMWH為成分復雜的混合物，所以無法以藥代動力學為生物等效性評價的終點指標，需進行人體藥效學生物等效性研究。同時，FDA 通過個藥指南（依諾肝素鈉、達肝素鈉）制定LMWH仿制產品的5 項評價標準，其中第5項為使用抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性作為人體內PD終點生物等效性研究的檢測指標。因此，生物樣本中抗Xa因子、抗Ⅱa因子活性是LMWH仿制產品等效性評價的重要依據。

抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性的生物分析方法一般使用二步顯色法（2 Stages Heparin Assay），其原理是抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）與肝素結合后，對血漿中凝血絲氨酸蛋白酶（包括Ⅱa因子、Xa因子）的抑制作用會增加（也是肝素的抗凝作用機制）。在AT-Ⅲ、凝血因子（Ⅱa或Xa）過量條件下，肝素與AT－Ⅲ結合后，再結合凝血因子，只有未被結合的凝血因子才能發揮水解活性，將顯色底物（對硝基苯胺，pNA）從特異性底物中釋放出來。未被結合的凝血因子與肝素濃度負相關，最終測定的顯色底物吸光值與肝素濃度呈負相關。

在實踐中，該類產品的生物分析主要參照配體結合分析的相關要求，如9012《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，ICH M10 等。方法學驗證中主要考察項目包括準確度與精密度（包括批內考察、批間考察）、選擇性（健康人基質、溶血基質等）、平行性、定量范圍、稀釋線性和鉤狀效應、穩定性等。以下簡述六種方法驗證及樣本分析的主要關注點：

（一）該體系顯色較快，須嚴格控制每步孵育時間及孵育溫度，在操作時用計時器精確到秒，力求優異的實驗結果。

（二）穩定性數據是方法穩定的重要支柱，全面驗證標準品/受試制劑/參比制劑在各條件下的穩定性以證明待測物的穩定性及方法的耐用性。其驗證項包括：①儲備液穩定性；②全血穩定性（不同溫度）；③血漿樣本穩定性（凍融循環、不同溫度）；④樣品前處理過程中的穩定性；⑤處理后樣品穩定性（不同儲存條件）。因涉及到標準品、參比制劑與受試制劑，故穩定性樣本是一般項目的3倍，復雜且龐大，需要實驗人員邏輯清晰，步步謹慎。

（三）在以發色底物法測定抗Ⅱa/Xa活性中，生物樣本不同程度的溶血會對活性檢測有不同程度的影響，使檢測結果出現偏差。因此，在方法學驗證時對血漿樣品不同程度的溶血情況進行考察，并拍照留檔為后期試驗提供數據支持，為臨床機構和分析測試中心提供判斷標準。

（四）血樣的采集與處理也可能會影響血漿中抗Xa因子、抗Ⅱa因子的活性，因此，采血條件、抗凝劑種類及濃度、采血后抗凝管的混勻操作、允許的離心前放置條件（時間、溫度） 、離心條件（時間、溫度、速度） 均須進行提前規定，并且與分析方法驗證考察時使用的條件一致。

（五）因溶血、脂血、黃疸等樣本均可能干擾抗Xa活性的測定。我們從源頭控制輕柔采血、細心處理樣本，盡量避免溶血。同時建立雙方統一的溶血程度判斷標準并記錄，在樣本交接時的溶血狀態確認與記錄。

（六）肝素類產品的生物樣品分析通常會使用微孔板，將每個板作為獨立的分析批，使用獨立的校準曲線和質控樣品。同一例受試者的全部樣品盡可能分布在同一分析批以減少結果的變異，如果一塊分析板無法包括全部樣品，分析計劃中應規定同一例受試者樣品在分析批間的分布方案。板位信息、讀板值等原始數據均應完整保存，并完整匯報。

目前FDA和EMA對等效性評價指標有所差異，主要集中在是否將抗Ⅱa 因子活性作為主要等效依據以及對等效性的判斷標準。NMPA建議將抗Xa因子活性作為主要PD等效性評價依據、抗Ⅱa因子活性作為支持性依據，但對分子鏈相對較長的LMWH產品需要同樣考慮評價抗Ⅱa 因子活性。因此，在LMWH 生物樣本分析中，須同時檢測抗Xa 因子、抗Ⅱa 因子活性，并在總結報告中匯報。

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